hisat2比对率低的原因(对比工具有哪些)

大家好，今天来介绍hisat2比对率低的原因(hisat2建立索引需要多久)的问题，以下是渲大师小编对此问题的归纳和整理，感兴趣的来一起看看吧！

那令人困惑的比对工具选择啊~

我可能不适合做科研，因为我总是对一些“ 没有必要 ”的事斤斤计较~

刚开始接触二代测序时，是跟着Jimmy大神从RNA-seq开始入门的。那时候使用的比对工具是HISAT2。当时也没怎么细想为什么用这个工具，你说用那我就用吧，于是HISAT2就成了目前我最喜欢的比对工具

但是，随着需要处理不同的数据，我发现HISAT2不能满足我的要求了，我似乎需要考虑其他工具了，但我无从下手，不知道什么工具更适合我。于是一场不太考虑生物学意义，只思考工具特点的战斗便拉开了帷幕……

虽然每次我都说这是废话猛备超多系列，但我是真心想让你们认真看看这部分的内容。毕竟我能力有限，很难用几句简短的话把段行我想说的事情搞明白，除非我写文言文……

搜了搜各种帖子，发现大家在对比对工具进行比较时，都喜欢将其分为DNA比对工具（DNA-seq）和RNA比对工具（RNA-seq）。仔细思考你会发现，它们的区别仅在于是否会考虑跨外显子的比对（即：是否会将没有比对上的reads劈开，对劈开后的两部分再次比对）。

随着现在各种seq的出现，我们已经不能简单的根据是比对DNA还是RNA来判断工具的选择，而是要判断reads的比对是否需跨外显子。比如PRO-seq/GRO-seq，它们在建库时捕获的RNA，但是它们并不需要考虑跨外显子的比对。

鬼扯了这么多，简单总结一下各种类型的常用工具都有哪些：

bowtie出现在上古时期（就是很久远的意思了），那个时候测序行业的发展还不成熟，序列长度普遍在50bp以下，因此bowtie的出现就是为了满足长度在50bp以下的reads的比对。官方称其可以把短的DNA序列（35bp）快速的比对到人类基因组上。

而bowtie2的出现则弥补了bowtie的短板，bowtie2擅长比对50-100bp长的reads，长度甚至长达1000。它适合比对那些比较长的基因组，如哺乳动物基因组。

结论：bowtie和bowtie2，是两个不同类型的比对工具，bowtie2并非是bowtie的升级。尺有所长寸有所短，bowtie适合长度在50b长度以内的reads比对，而bowtie2适合50-100b，甚至更长的reads比对。但是这两个都属DNA-seq比对工具

Tophat/Tophat2工具本身不能进行比对，它是通过调用bowtie/bowtie2进行比对的。划重点， bowtie2不是bowtie的升级版，但是Tophat2是Tophat2的升级版 。因此Tophat只可以调用bowtie，而Tophat2不仅可以调用bowtie2（默认）还可以更改设置调用bowtie。

Tophat/Tophat2调用bowtie/bowtie2后，会首先使用bowtie/bowtie2对序列进行比对，对于那些没有比对上的，会考虑其跨外显子的可能性，将reads劈开重新比对。

如果你去bowtie/bowtie2/Tophat的官网仔细观察，你会发现，bowtie和bowtie2各自有自己的官网，有专属于自己的介绍。而Tohat就不同了，它只有一个，仅仅是在2012年4月9日Tophat发布了2.0.0版本，宣布支持bowtie2的比对。而我们通常也将支持bowtie2版本的Tophat称之为Tophat2。

此外，如果你够无聊，你在它们的主页上下扒拉扒拉，你会发现无论是bowtie还是bowtie2在2019年仍然是有更新的。但是Tophat到了2016年2月便停止了更新……这是为什么呢？请继续往下看

Tophat2的原作者们也不知道是出于什么考虑，不握知哗再更新Tophat2，转而开发了一个新的比对工具HISAT2，更是推荐人们使用HISAT2，声称其速度更快，内存占用率更小，准确率更高。

此外，HISAT2不仅支持RNA-seq的比对还支持DNA-seq比对，唯一需要做的就是加上一个参数 –no-spliced-alignment 。但是就目前来看，大部分人都是使用HISAT2做RNA-seq，没人使用它做DNA-seq

其实没有太多需要说的，是我最早知道的比对工具，属于DNA-seq比对工具。大部分搞全基因组或者全外的似乎都使用BWA作比对。当时本科时期有门课叫做计算生物学，当时学习BWT算法，还经常把算法名称和比对工具名称搞混。

值得一提的是这个工具是李恒开发的，如果你不知道李恒，你最起码也应该知道SAMtools工具，这东西也是李恒开发的。一个强的可怕的男人……

最早听到这个工具的名称是在研一时期，的确有点孤陋寡闻。当时以为是一个很小众的野鸡工具，后来发现身边蛮多人用这个工具的，于是就带着好奇心上网搜索它的资料。

不搜不知道，一搜吓一跳。啧啧啧，ENCODE皇家御用的RNA-seq比对工具，真香……

可能是因为RNA-seq分析比较大众，因此大部分的比对工具都是利用RNA-seq的效率进行比较。

《Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis》这篇文章可以称之为史上最全RNA-seq测评。对于RNA-seq的方方面面都进行了比较。因为太全面，反而有点杂乱，因此我只关注了我感兴趣的一些地方。

无论是HISAT2还是STAR，对于Tophat来说都有很大的优势，更何况Toph还不再继续更新，这就更给力我们不再使用它的理由。至于HISAT2，他的junction正确率最高，但是灵敏度相对较低。而STAR灵敏度更高，但是会有许多包含soft-clip的低质量比对。此外，STAR的unique mapping比例最高，它对于双端测序的reads，要么全部比对上，要么全部抛弃，不会像像TopHat和HISAT2一样只比对上某一个reads

最后这篇文章还给了一个它认为比较好的RN-seq组合方式：

前一阵的龙星课程针对RNA-seq给出了另一个组合方式：SATR+RSEM，其中STAR既可以比对也可以用于定量（count）

具体选用哪一个组合，看习惯，看眼缘，看心情……

HISAT2 建立索引警告和比对时报错解决方案

tags： HISAT2 RNA-seq

HISAT2 发表的文章中强调了它的速度很快，我就测试了一下这个工具。

HISAT2 建立索引：

然而没多久就看到这样的警告：

只是警告，并没有报错。

HISAT2 建参考索引很慢，等 HISAT2 建完索引（建索引花了 16 个小时），然后用 HISAT2 比对 RNA-seq 数据测试。

几分钟之后报错了：

github 上有人在 HISAT2 项目中报告过这个错误，虽然没有最终讨论出解决办法，但是都觉得跟建索引不完整有关，或许与建索引时候的警告有关。我查了一些资料，综合 biostar 和 SEQanswer 中的讨论，建立索引时遇到的警告是由于参考序列中存在大段的 n 碱基导致的，例如其中一条 fasta 中 n （我遇到的是小写的 n）太多。解决办法也很简单，过滤掉参考序列中长度小于 50bp 的 contig 和序列中连续 n 碱基超过 40bp 的contig 。然后重新建索引，就没有任何警告了，但是会损失部分参考序列。这样处理之后建的索引再睁唤庆用 HISAT2 比对 RNA-seq 数据，就没有问题了。

HISAT2 比对速度确实很快，一个样本转录组数据比对 2G 的核糖体 RNA 参考基因组约 25 分钟，bowtie2 需要 170 分钟（线程数都是 4）。 bowtie2 的 local 模式比对出 21% 的 rRNA 污染链宴，而 HISAT2 比对 2% 的 rRNA 污染，差异也挺大的……

但是，HISAT2 的线程数不能设置太高，用户手册中建议对人类参考基因组进行比对时，线程数设置在 1-8 之间。我用文献悉握 Transcript-level expression analysis of RNA-seq
experiments with HISAT, StringTie and Ballgown 中的数据测试也发现当线程数超过 12 时整个比对步骤消耗的时间反而会增加。

真核生物mRNA测序

一、真核生物mRNA的结构：

二、建库方式：
真核生物mRNA含有poly-A尾，因此最常用的富集真核生物mRNA的方法就是采用附着poly-T oligo的磁珠从total RNA 中抓取mRNA。建库示意图如下图所示：
1、提取总RNA：提取总RNA后需要对其进行质量检查，包括纯度、浓度和完整性（RIN）。如果总RNA起始量太低，不能保证有足够的mRNA用于建库。另外RNA容易降解，而采用附着poly-T oligo的磁珠捕获降解后的RNA会产生3’偏好性，因此建议RIN值大于等于7。
2、mRNA捕获：真核生物的成熟mRNA带有poly-A尾，因此可以采用附着poly-T oligo的磁珠从总铅虚漏RNA中捕获mRNA。
3、mRNA片段化：
4、cDNA第一链合成：以mRNA为模板合成cDNA。
5、cDNA第二链合成：以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链。
6、双链cDNA末端修复：3’槐烂加A，5’修复。
7、加接头：
8、PCR富集mRNA文库。
9、上机测序。

三、生信分析：
1、数据拆分：利用bcl2fastq软件将bcl文件转换成fastq文件。
2、数据预处理：有些测序reads可能包含测序接头、引物序列、低质量碱基、N含量较高，因此通常需要对测序数据进行预处理，去除这些不合格的碱基或reads。常用的软件有fastp，cutadpater以及Trimmonmatic等。
3、质控分析：对预处理后的数据进行质控分析，通常采用fastqc。
4、参考基因誉高组比对：将测序数据与参考基因组进行比对，常用的比对软件有hisat2，tophat2，STAR等。
5、转录本的组装和定量：常用的软件有cufflinks，stringtie等。
6、差异分析：分析不同处理条件下基因或转录本的表达是否有差异，穿能够与的软件有DEseq2，edger，ballgown等。
7、富集分析：对差异基因进行富集分析，统计学原理是基于超几何分布。

Error: Encountered internal HISAT2 exception (#1)

废话不多说直接上问题
hisat2在比对的时候遇到如下问题
我一直以为是hisa2内部出了什么问题
结果。。。

这个报错应该很长很长以至于大家都忽略了上面的问题，一直关注最下面的error而百思不得其解。我这里是–new–summary多打了一个-，大家一定要仔激中细检查明旅山自己的输入命令，有时候多镇芦打一个少打一个都会出现奇奇怪怪的报错也包括空格。希望大家不要被各种error再困扰了！